淋病有哪些检查方法

淋病的检查大体可以分为以下几种：

实验室检查：

淋球菌实验室检查包括涂片，培养检查淋球菌、抗原检测，药敏试验及ppng测定，基因诊断。

(一)涂片检查：

取患者尿道分泌物或宫颈分泌物，作革兰氏染色，在多形核白细胞内找到革兰氏阴性

双球菌。涂片对有大量脓性分泌物的单纯淋菌性前尿道炎患者，此法阳性率在90%左右，可以初步诊断。女性宫颈分泌物中杂菌多，敏感性和特异性较差，阳性率仅为%，且有假阳性，因此世界卫生组织推荐用培养法检查女病人。慢性淋病由于分泌物中淋球菌较少，阳性率低，因此要取前列腺按摩液，以提高检出率。

咽部涂片发现革兰氏阴性双球菌不能诊断淋病，因为其他奈瑟菌属在咽部是正常的菌群。另外对症状不典型的涂片阳性应作进一步检查。

(二)培养检查：

淋球菌培养是诊断的重要佐证，培养法对症状很轻或无症状的男性、女性病人都是较敏感的方法，只要培养阳性就可确诊，在基因诊断问世以前，培养是世界卫生组织推荐的筛选淋病的唯一方法。目前国外推荐选择培养基有改良的thayer-martin(tm)培养基和newyorkcity(nyc)培养基。国内采用巧克力琼脂或血琼脂培养基，均含有抗生素，可选择地抑制许多其他细菌生长。在36℃，70%湿度，含5%-10%co2(烛缸)环境中培养，小时观察结果。培养后还需进行菌落形态，革兰氏染色，氧化酶试验和糖发酵试验等鉴定。培养阳性率男性80%-95%，女性%。

(三)抗原检测

1.固相酶免疫试验(eia)：可用来检测临床标本中的淋球菌抗原，在流行率很高的地区而又不能作培养或标本需长时间远送时使用，可以在妇女人群中用来诊断淋球菌感染。

2.直接免疫荧光试验：通过检测淋球菌外膜蛋白i的单克隆抗体作直接免

疫荧光试验。但目前在男女二性标本的敏感不高，特异性差，加之实验人员的判断水平，故该实验尚不能推荐用来诊断淋球菌感染。

(四)基因诊断

1.淋球菌的基因探针诊断

淋球菌的基因探针诊断，所用的探针有：质粒dna探针，染色体基因探针和rrna基因探针。

(1)质粒dna探针

①隐蔽质粒dna探针，淋球菌质粒分为三种：接合性质粒，分子最大，为36kbdna;耐药性质粒包括两个质粒，dna长分别为5.6kb和7.1kb;隐蔽质粒4.2kb。其中隐蔽质粒存在于96%的临床淋球菌分离株中，其它奈瑟菌不含有此质粒，故可用它的序列作为特异dna探针检测淋球菌。torres采用核酸杂交技术检测淋球菌，所用探针为隐蔽质粒。用该探针对134株淋球菌和131株相关菌株的检测，有124株淋球菌杂交反应阳性，占93%，还可与个别其它的奈瑟菌出现交叉反应，对测定探针的敏感性实验表明可检出102cfu淋球菌。研究证明隐蔽质粒中cppb基因序列在所有的淋球菌染色体中(包括不含该质粒的菌株)。因此cppb基因探针具有良好的特异性和敏感性。torres等用cppb基因探针检测了201份临床标本，采用非放射性地高辛标记系统，其敏感性和特异性分别为95%和98%。

②耐药性质粒dna探针

淋球菌的抗药质粒可分为：①产青毒素酶淋球菌(ppng)其-内酰胺酶阳性;②具有高水平的质粒介导的耐四环素淋球菌(trng)。

ppng菌株是1976年首次在实验室分离得到的，该菌中含有编码产青毒酶的基因，该基因既可整合于染色体上也可出现在质粒dna中，而后者居多，称之为产青毒素酶质粒，质粒有二种，大小分别为7.4kb和5.3kb。pescador1998年设计一特异的检测淋球菌编码-内酰胺酶基因的探针，采用酶化学发光法标记，液相杂交，用测光计测是特异杂交体的光量。在4h内可检测cfu的ppng菌株。trng菌株虽对四环素耐药，但通常对-内酰胺酶类及喹诺酮类抗菌素敏感。因此，在实验室药敏检测中可归为敏感细菌。pescador用抗四环素淋球菌(trng)tetm基因的寡核苷酸探针,该基因介导抗四环素,用酶化学发光标记,液相杂交,4h内可直接从临床标本中检出含有tetm基因的1.5104cfu的淋球菌。

(2)染色体探针

染色体探针包括已知功能的基因探针，如菌毛dna探针和pai基因探针，这些基因在淋球菌感染人细胞的过程中起着重要作用;未知功能的基因探针，这些探针序列与染色体的特定序列互补，但目前还不知这些基因序列的功能。以上两种染色体探针由于在淋球菌中互补序列的拷贝数较低，检测灵敏度较低，因此一般用的不多，除非有特殊的研究目的。

(3)rrna基因探针

rrna基因探针是将与rrna互补的dna作为探针，该探针的靶序列是rrna序列。rrna的基因探针的特点是：①可以增加探针检测的灵敏度，rrna基因探针可同时检测rrna分子和dna分子;②rrna具有进化上的保守性;③杂交方法简便、快速;④由于rrna的含量较高，标本不需增菌。美国gen-probe公司生产的淋球菌检测探针pacec，是以rrna及其基因为检测靶序列，采用放射性标记，在2h内可以完成检测，peter用这种探针检测395个临床标本，结果灵敏度和特异性分别为92.9%，99.4%，他认为pacec系统筛查临床标本中淋球菌是一个可靠的方法。该探针还可以检测无症状淋球菌感染者，这是目前培养难于达到的。

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2、淋球菌的基因扩增检测

上面讲述的探针技术检测淋球菌的方法，虽然比培养方法在灵敏度，特异性和方便性上有了很大的提高，但其仍有一定的局限性，如多数情况下需要标本的淋球菌浓度很高，pcr技术和连接酶链反应的出现进一步提高了检测淋球菌的灵敏性，它具有快速、灵敏、特异、简便的优点，可以直接检测临床标本中极微量的病原体。

(1)淋球菌dna的提取

①培养菌的dna提取

将培养得到的淋球菌，以102cfu/ml的浓度溶于碱性裂解液中裂解，裂解液组成为：1mnacl1mnaoh和1%sodiumdodecylsulphate。将裂解液混匀后煮沸1min，然后用100l的1mtrisph7.0中和碱性裂解液。用tris平衡酚提抽一次，酚氯仿抽提一次，然后用无水乙醇或异丙醇沉淀dna，提取的dna溶于30l蒸馏水或te缓冲液中。

②临床棉拭子标本的提取

将贴有分泌物的棉拭子在2ml的无菌生理盐水中或pbs缓冲液中挤压洗1min，以便将标本尽量溶于溶液中，将棉拭子弃去，悬浮液于r/min离心5min，吸去上清液，细胞重新溶于100l1pcr缓冲液，其中含tween200.45%,蛋白酶k200g/ml，细胞悬浮液于℃温浴1h,然后95℃加热10min以灭活蛋白酶k,12000r/min离心10min,上清液含dna模板。

(2)pcr引物的设计

由于淋球菌隐蔽质粒cppb基因在淋球菌染色体中和4.2kb隐蔽质粒中都有存在，同时在96%的淋球菌中都有该隐蔽质粒，因此很多pcr引物设计在cppb基因区。

靶基因引物序列片段长度(bp)

cppbng15gtttggctggttgattcaag3633

ng25gcaagatttccgatttggcg3

cppbho15gctacgcatacccgcgttgc3390

ho25cgaagaccttcgagcagaca3

rrna引物15-aggctgttgccaatatcggc-3206

引物25-acactcgagtcacccagttc-3

cppbgc15cttatcgtttggctggttgattc3435

gc25accaagaccaaaggtttgacactg3

gc35attttccagtgtcaaac3241

gc45tattcaagccctatctg3

(3)pcr扩增

取淋球菌dna提取液2l，加入28l的反应液中，最终pcr反应液中含dntp各100mol/l，引物各0.5mol/l，taqdna聚合酶1u，mg2+1.5mmol/l,加无菌石蜡油30l，1000r/min离心30s，进行pcr扩增循环，反应条件：94℃变性1min，然后94℃30s，57℃1min，72℃1min。共30个循环，最后72℃延伸5min。

扩增产物于2%的琼脂糖凝胶电泳30min，溴化乙锭染色，紫外灯下可见扩增的dna荧光条带，分子大小应与所用引物扩增靶序列的大小一致。

(4)pcr的灵敏性和特异性

由于cppb在不含有隐蔽质粒的淋球菌染色体上也会含有cppb基因，再加96%的淋球菌都会有隐蔽质粒，因此用cppb作为靶序列的引物具有极高的敏灵性，实验证明，一般传统一步pcr(gc1-gc2)方法可以检出3个淋球菌，而用单管巢式pcr(gc2-gc4)可以检出0.3淋球菌(9个cppb基因)。这些引物经特异性实验，只能扩增淋球菌的dna，而对非淋球菌奈瑟氏菌扩增不出特异产物。

(5)单管巢式pcr方法

是在传统巢式pcr的基础上将两对pcr引物作特殊的设计，巢式外侧两个引物(gc1，gc2)为25b退火温度比较高(68℃)，巢式内侧两个引物gc3-gc4为17b退火温度较低(46℃)，pcr反应液的其它成分与一般pcr相同。这样，通过控制退火温度(68℃)使外侧引物先行扩增，经过次循环后(第一次pcr)，再降低退火温度(46℃)使内侧引物以第一次pcr产物为模板进行巢式扩增，该pcr的灵敏度可达到检出0.3个淋球菌。

(6)淋球菌连接酶链反应(lcp)检测方法

目前pcr检测淋球菌的方法被广泛地使用。其特异性，灵敏性不断提高。同时另一种基因诊断技术连接酶链反应(lcp)也以其高特异，高灵敏性被应用于淋球菌的检测中。lcp与pcr不同之处在于lcp用四对引物，所用酶是连接酶。连接酶可以将两条相邻引物连接起来。连接起来的两条引物可以作为另两条引物的模板，后者在连接酶作用下连接，又可作为模板，如此进行次循环。lcp所用的模板处理方法与pcr模板制备相等。lcp所用的探针除了可以设计在cppb基因上，也可以设计在染色体基因序列上，例如opa-1基因。美国abbott实验室在opa-1基因的48bp长的区域内设计了4个lcp探针，由于opa-1基因在淋球菌的染色体中有11次重复。因此，该组lcp探针具有高灵敏性和特异性。lcp反应过程：

将模板加入lcp反应液中，lcp反应液：20mmol/ltris-hclph7.6;100mmol/lkcl10mmol/lmgcl2;1mmol/ledta;10mmol/lnad+;10mmol/ldtt,有标记物的两个相邻探针各40fmol/l，未标记的探针各40fmol/l，15u耐热连接酶，反应条件：97℃1s，55℃1s，62℃50s，其40循环。100l反应产物加入酶标板微孔中，进行显色反应，最后用酶标仪读取光值。根据buimer的实验证明，lcp在检测男性尿道棉拭子标本的灵敏度为100%，尿液标本为88.9%，女性宫颈棉拭子标本为95.4%。lcp方法的特异性高达100%，这一点明显高于pcr的特异性，避免了假阳性的发生。

3.临床基因诊断淋球菌的注意事项

目前临床检测淋球菌的基因诊断方法主要采用pcr方法，但是该方法在临床检测中应注意几个问题。

(1)引物设计除了以上所列的淋球菌pcr引物外，还可从在其它基因上设计，但

是引物序列应具有特异性。因为细菌的染色体较大，许多基因序列并没有搞清楚;同时细菌之间或近或远有一定的同源性，而且细菌所含质粒序列间也存在同源性，因此设计引物一定要进行基因数据库比较分析，同时进行特异性和灵敏性实验，从中选择引物进行临床检测。

(2)临床标本处理对临床标本来讲，pcr模板要求越纯越好。这就要求在采集标本时要取到准确的位置，对于无症状患者要适当多采样，以保证采集到病原体细菌。另外由于临床标本成分比较复杂，有时简单处理的标本pcr扩增效果并不理想，这可能是由于杂质过多造成的,需要进一步纯化，如用酚一氯仿抽提法纯化，结果将会好转。这种纯化方法比较麻烦,目前已有商品化的dna纯化试剂盒,可以较简便地从临床标本中提取高纯度的dna。

(3)pcr产物的检测方法不久以前临床pcr检测淋球菌几乎都采用电泳的方法进行pcr产物的鉴定。该方法存在许多问题，如由于肉眼观察的主观性而造成假阳性和假阴性的结果。目前用杂交显色法代替电泳法，提高了结果判断的特异性和灵敏性。

总之，pcr方法与lcp方法比传统的培养法在灵敏性和特异性上有了很大的提高，时间也大大缩短。随着基因诊断技术的不断改进。pcr方法与lcp方法在淋球菌的检测将会成为常规的检测方法。

(五)药敏试验：在培养阳性后进一步作药敏试验。用纸片扩散法做敏感试验，或用琼脂平皿稀释法测定最小抑菌浓度(mic)，用以指导选用抗生素。

(六)ppng检测：-内酰胺酶，用纸片酸度定量法，使用whatmani号滤纸pp-ng。

菌株能使其颜色由蓝变黄，阳性为ppng，阴性为n-ppng。

以上就是对淋病几种检查方法的阐述，希望对你有所帮助，当发现自己有淋病症状的患者要及时的去医院检查，做到早诊断，早治疗，有效的防止淋病发生。